电转感受态细胞TG1
产品说明:
转化效率可达4×1010 cfu/μg pUC19以上
保存条件:
收到货后请立刻放入-80℃冰箱的下层,6个月保质期。请勿保存于液氮中。保存温度的微小变动都会导致感受态效价的大幅降低。
使用方法:
- 电转感受态 (30 μL/支)
- pUC19质粒(10 pg/μL)
- 连接产物(自制)
- 0.1cm 电转杯(BTX,45-0124)
- 电转仪(Biorad,165-2662)
- 14mL圆底摇菌管(BD,352059)
- 氨苄抗性的9cm直径LB平板
- SOC液体培养基
- 将摇床设定为37℃,250rpm,开启预热备用;
- 1个含有975μL SOC、1个含有990μL SOC、2个含有900μL SOC的 14mL无菌圆底摇菌管,放入开启的摇床中预热;
- 将电转杯插入冰中预冷;
- 将电转仪调至1800V电压,600Ω电阻,10μF电容(如果电转在冷房里进行更好);
- 将电转感受态细菌插入冰中放置3~5分钟解冻后,
- 转化pUC19质粒检测感受态细菌转化效率:
加入1μL 10pg/μL pUC19质粒,轻柔吹打或手指轻弹管底混匀,插入冰中继续放置1分钟;
- 转化小量连接产物
加入1μL 连接产物,轻柔吹打或手指轻弹管底混匀,插入冰中继续放置1分钟;
- 转化大量连接产物
先用酚氯仿纯化连接产物,用ddH2O重悬DNA沉淀后,吸取适量(体积≤2μL,浓度≤100ng/μL)加入到电转感受态细菌中,轻柔吹打或手指轻弹管底混匀,插入冰中继续放置1分钟;
- 取出37℃预热的装有975μL SOC培养基的摇菌管放在超净台试管架上;
- 取出预冷的电转杯在超净台上放平并擦去表面水分,将菌液-DNA混合液沿壁转入电转杯中(最好不要产生气泡,如果产生气泡则要在超净台上轻磕一下电转杯去除气泡,否则会产生电火花),放入电转仪中电击,电击后10秒内加入975μL预热的SOC培养基(时间恒定值最好在3.5-4.5ms之间);
- 立刻用移液枪将1mL细菌悬液全部吸出转入14mL无菌圆底摇菌管中,37℃,250rpm培养1小时
- 吸出10μL细菌液加入到990μL 预热的SOC培养基中混匀;取100μL稀释液加入到900μL 预热的SOC培养基中混匀;再取100μL稀释液加入到900μL 预热的SOC培养基中混匀;则菌液梯度稀释了100,1000,10000倍,再从低浓度到高浓度分别取100μL涂布在氨苄抗性的9cm直径LB平板上,37℃倒置培养过夜后,统计菌落数
电转感受态细胞的转化效率计算说明:
假如1000倍稀释且涂布了100μL稀释液的平板上长出了40个克隆,则计算方法如下:
40/(10pg/1000) x (1mL/100 μL) = 4x104cfu/pg =4 x1010cfu/μg